研究目的
利用拉曼显微镜和化学计量学方法研究纳米制造支架及细胞-支架复合体的结构与生化特性，并评估支架结构对细胞体、细胞核形态及生化特性的影响。
研究成果
拉曼显微光谱技术（RMS）是一种无损、无需标记的技术，可用于细胞-支架复合体的原位分析。该技术能够实现支架拓扑结构和细胞生化成分的三维成像，揭示细胞迁移过程中细胞核形态及生化变化的细节。未来应用可能包括活细胞研究以及三维环境中细胞核-细胞骨架相互作用的解析。
研究不足
对整个细胞和支架进行三维拉曼成像可能需要数小时，若未经优化可能不适用于活细胞研究。背景信号在不同z平面存在差异，这增加了数据分析的复杂性并需要谨慎选择遮光参数。该研究使用固定细胞，限制了对动态过程的实时观察。
1：实验设计与方法选择：
本研究采用拉曼显微光谱（RMS）结合化学计量学方法（如主成分分析），对三维细胞支架及细胞-支架复合物进行研究。支架通过直接激光写入（DLW）技术，使用紫外光固化杂化聚合物（OrmoComp和IP-Dip）制备。拉曼三维成像采用共聚焦拉曼显微镜配合特定激光器与物镜完成，数据预处理包括宇宙射线去除、平滑处理、背景扣除及主成分分析。
2：样本选择与数据来源：
支架使用OrmoComp和IP-Dip材料，在ITO镀膜盖玻片和熔融石英等基底上制备。人结直肠腺癌细胞系（Caco-2）被培养于这些支架上。拉曼分析前使用多聚甲醛固定细胞以防止降解。
3：实验设备与材料清单：
设备包含共聚焦拉曼系统（inVia，雷尼绍公司）、用于DLW的Photonic Professional GT（Nanoscribe公司）、532纳米与785纳米激光器、60倍水浸物镜等，材料包括OrmoComp、IP-Dip、氟化钙窗口片及细胞培养试剂（如最低必需培养基、胎牛血清）。
4：实验流程与操作步骤：
支架在AutoCAD中设计，通过DLW制备并用特定溶液显影。细胞接种至支架后固定，以设定采集时间、步长和激光功率获取拉曼图谱。三维成像需在z平面采集拉曼图谱堆栈。
5：数据分析方法：
数据预处理使用Wire 4.0软件进行宇宙射线去除、平滑处理及背景扣除。主成分分析通过MATLAB实现，包含光谱中心化与归一化处理。伪彩色阴影图与分布图辅助可视化生化物质分布。
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Direct-laser writing system
Photonic Professional GT
Nanoscribe GmbH
Used for fabricating 3D scaffolds via two-photon polymerization with precise geometries.
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Polymer
IP-Dip
Nanoscribe GmbH
Used as a resist for high-resolution immersion direct-laser writing to fabricate 3D scaffolds.
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Objective
LUMPLFLN 60XW
Olympus
Used as a water immersion objective for Raman measurements of scaffolds and cells in DPBS buffer.
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Substrate
Fused silica substrate
Nanoscribe
Used as a substrate for fabricating IP-Dip scaffolds.
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Raman system
inVia
Renishaw plc
Used for confocal Raman microspectroscopy to acquire 3D Raman maps of scaffolds and cells.
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Polymer
OrmoComp
Micro Resist Technology GmbH
Used as a material for fabricating 3D scaffolds; supports cell adhesion and is Raman-compatible.
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Software
Wire 4.0
Renishaw plc
Used for preprocessing Raman data, including cosmic ray removal, smoothing, and background subtraction.
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Software
MATLAB
MathWorks
Used for data analysis, including principal component analysis (PCA) and distribution plot generation.
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Software
AutoCAD
Autodesk
Used for designing 2D and 3D scaffold structures in .dxf and .stl formats.
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Coverslip
ITO-coated glass coverslips
Diamond Coatings
Used as substrates for fabricating OrmoComp scaffolds.
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Window
Calcium fluoride window
Used as a Raman-compatible substrate for single-cell analysis.
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