研究目的
提供一个详细的协议，用于利用基于nlsGPS1 FRET的生物传感器来可视化和量化植物细胞中的赤霉素水平，从而实现细胞尺度上GA梯度的时空定位。
研究成果
nlsGPS1 FRET生物传感器能够对植物组织中的赤霉素（GA）梯度进行定量时空绘图，揭示与细胞伸长相关的内源性和外源性GA分布模式。该传感器为GA生物学提供了高分辨率的见解，但在可逆性和组织适用性方面存在局限。未来的生物传感器代际产品有望提升可逆性与特异性。
研究不足
nlsGPS1生物传感器不具备快速可逆性，因此它报告的是近期最高赤霉素浓度而非实时稳态水平，无法检测赤霉素浓度的下降过程。该传感器需要较高的信噪比，且不适用于荧光蛋白难以检测的组织（如深层组织）。该传感器对GA4具有高亲和力，但对其他赤霉素的亲和力较低，其精确的周转速率尚不明确。
1：实验设计与方法选择：
该方案使用nlsGPS1 FRET生物传感器进行共聚焦成像，以监测拟南芥组织中的GA水平。包括稳态测量、GA4处理前后对比以及时间进程实验。FRET成像采用特定激光激发和CFP/YFP发射检测。
2：样本选择与数据来源：
使用表达nlsGPS1或nlsGPS1-NR（非响应变体）的拟南芥种子。组织包括根和暗培养下胚轴。样本在受控条件（光照、温度、湿度）下生长。
3：实验设备与材料清单：
共聚焦显微镜（如配备10x或20x物镜的显微镜1和2）、激光器（448 nm用于CFP激发，514 nm用于YFP激发）、探测器（HyD SMD、ChS）、灌注系统（如粘性载玻片）、注射器、管路、鲁尔接头、Murashige和Skoog（MS）培养基、GA4、乙醇、真空脂、盖玻片、镊子、生长室。
4：2）、激光器（448 nm用于CFP激发，514 nm用于YFP激发）、探测器（HyD SMD、ChS）、灌注系统（如粘性载玻片）、注射器、管路、鲁尔接头、Murashige和Skoog（MS）培养基、GA乙醇、真空脂、盖玻片、镊子、生长室。 实验步骤与操作流程：
4. 实验步骤与操作流程：包括种子灭菌、在MS琼脂上培养植物、在显微镜载玻片或粘性载玻片上制备样本、共聚焦成像（设置z轴堆栈和时间序列）、通过化学交换或灌注进行GA4处理，以及按特定参数（如512 x 512像素、12位分辨率、无像素饱和）采集图像。
5：数据分析方法：
使用Fiji（ImageJ）进行二维比值图像分析，商业三维可视化软件用于细胞核分割和比值计算。统计分析包括正态性检验、t检验、Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis方差分析（基于数据分布）。
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Confocal Microscope
microscope 1, microscope 2
Used for FRET imaging with specific laser excitations and emission detections to acquire images of nlsGPS1 biosensor in plant tissues.
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Perfusion System
sticky-slide
IBIDI
Used for time-course experiments to perfuse mock or GA4 solutions through the sample chamber for controlled treatment.
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Syringe Pump
Used to control the flow rate of solutions in perfusion experiments for precise delivery of mock or GA4 treatments.
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Software
Fiji
Used for 2D image analysis of nlsGPS1 emission ratios, including background subtraction, channel splitting, and ratio computation.
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Software
commercial three-dimensional micrograph visualization and analysis software
Used for 3D image analysis, nucleus segmentation, and computation of nlsGPS1 emission ratios from confocal z-stacks.
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Growth Chamber
Used to grow Arabidopsis plants under controlled environmental conditions for consistent sample preparation.
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Murashige and Skoog Medium
MS basal medium
Used as growth medium for Arabidopsis seeds and as base for mock and GA4 solutions in experiments.
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GA4
Used as exogenous gibberellin treatment to study GA accumulation and gradients in plant tissues.
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